PNA 序列设计指南

关于肽核酸

肽核酸（Peptide Nucleic Acid，PNA）是一种人工合成的类似于 DNA 或 RNA 的聚合物。与多肽类似，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接到主链骨架上。由于 PNA 不带负电荷，与 DNA 和 RNA 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高。不易被 DNA 酶和蛋白酶水解，PNA 在体内以及体外极其稳定。

PNA 的主要应用

• 序列特异性的 PCR 抑制剂（PNA 夹）
• 端粒、着丝粒 FISH 探针，基因特异性探针，感染试验
• 反义/抗微生物试剂
• miRNA 抑制剂
• 双链 DNA 侵入和捕获
• 微阵列探针

非标记 PNA

由于其高亲和力和特异性，PNA 能有效结合靶核酸。未标记的 PNA 通常作为基因的 PCR反应的特异性阻断剂（PNA 夹）。这种技术可以有效地检测靶基因中的 SNP 突变。

PNA 倾向于定向且逆平行结合到靶核酸。PNA 5' 端的氨基（也写为 5' 或 H-），可以结合其它功能基团，PNA 3' 端的酰胺基（也写为 -NH2 或 3'）反应活性弱。5' 端乙酰化可以阻止其继续发生反应。

因为 PNA 的解链温度 Tm 高于 DNA，一般情况下，大部分使用的 PNA 的长度为 10~21 个碱基。PNA 链越长，溶解性越差。嘌呤含量高（＞60%）尤其是碱基 G，是导致溶解性差的原因。根据序列，PNA 链最大长度约为 40 个碱基。然而，我们强烈建议检查 Tm，设计探针应具有适当的长度和序列。

当 PNA 链较长（>22mer）或者嘌呤含量高（＞60%）时，为了提高 PNA 探针的溶解性，我们建议在序列中加入一些助溶基团如 O linker、E linker、X linker 或者两个赖氨酸。当 PNA 偶联多肽或染料时，接头（linker）可以起到空间间隔（spacer）的作用。

• 可能用到的接头：
- O linker（也称 AEEA 或 eg1）：常用来提高溶解性
- 起到空间间隔作用：O、E、X、C3、C4、C6、C12
- 加入巯基：C6SH、C11SH

标记PNA

PNA链 5』端和 3』端均可以标记。由于 3' 端是非活性基团（-CONH2），所以需加入一个赖氨酸，其侧链上的氨基可以用来标记。

如果在 5' 端标记，我们建议在 PNA 和标记物之间加 1~2 O linkers。

标记物：荧光基团（—NHS 酯或羧基酰胺）、生物素、棕榈酸、DABCYL、叠氮化物、亚甲基蓝、巯基等。

PNA 具体设计规则：

• 长度: 合成 PNA 序列一般不超过 18 个碱基，但不包括接头、氨基酸和标记物。
• 含有氨基酸: 可以把一个赖氨酸或半胱氨酸联在序列的 N 端或 C 端。
• 嘌呤含量: 富含嘌呤 PNA 易发生聚合反应且水溶性差。为了避免聚合反应，请遵循以下原则：

1. 将嘌呤含量限制在 60% 以下。.
例如:
GAT TAG CAG TCT ACG (可行- 嘌呤含量 < 60%)

2. 连续嘌呤不超过 4 个，而鸟嘌呤则不超过 3 个。
例如:
ATT AGG GGC ATC TAC (不可行- 连续 4 个 G)
CTA GAT AGA AGG TTC (不可行- 连续 6 个嘌呤)

3. 如果无法避免上述规则，可以考虑探针互补链。
例如:
GTA GAT GCC CCT AAT (可行-上面序列的互补序列，未违背任何准则)
GAA CCT TCT ATC TAG (可行-上面序列的互补序列)

• 避免自我互补序列：反向重复、发夹和回文序列。由于 PNA/PNA 相互作用比 PNA/DNA 更强，这些类型的探针容易聚合。

1. 四个碱基互补是可行的， 但只含有 C 和 G 的除外。然而当它们被一个或多个碱基间隔时，也是可行的。
例如:
GAT AATT GCA (可行 - 四个碱基互补)
GAT CCGG TAC (不可行- 只有 CCGG 互补)
TAT CCT GGT A (可行， CC, GG 隔了一个碱基)

2. 6 个及以上碱基互补是不可行的。
例如:
CTA TTA ATG CA (不可行 - 6 个碱基互补)

3. 当被一个或多个碱基间隔时，6 个碱基互补是可行的，但只含有 C 和 G 的除外。
例如:
AGT GCT ACT (可行 - 中间有间隔 )
GCG GCT CGC (不可行 – 只有 G 和 C 互补)

4. 即使被一个或多个碱基间隔，8 个碱基互补也是不可行的。
例如:
ACTG T CAGT (不可行 - 8 个碱基互补)

一般规则：

• 我们强烈建议您设计逆平行的 PNA 探针。PNA 可以在任一方向形成双链，但逆平行取向优先，形成最普通双链。对于反义和 DNA 探针类型应用，逆平行是最优先构象。当逆平行取向时，PNA 探针的 N 端相当于 DNA的 5』端。
• PNA 熔点不同于 DNA。由于 PNA 链是不带电的，PNA-DNA 的 Tm 值会比相应 DNA-DNA 的高。通常情况下，100 mM NaCl 中，每增加一个碱基，其 Tm 值提高约 1 °C。在较低盐浓度下，其 Tm 值的差异将更加明显。通常，一个含 10 个碱基 PNA，其 Tm 值约 50 °C，含 15 个碱基的 PNA Tm 值约 70 °C。
• 长度为 12～17 个碱基的 PNA 序列是最佳的。序列长度主要取决于其具体应用。与 DNA 的应用相比，PNA 探针序列需要的长度更短。链长的 PNA，根据序列，倾向于聚合，不易纯化和表征 。然而，序列越短，特异性越强。因此，对于短序列来说，不匹配的影响更大。