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来试试合成 sgRNA 的新方法吧！
人阅读 发布时间：2020-08-04 13:47
体外转录（in vitro transcription，IVT）是用于产生 CRISPR-Cas9 基因编辑系统中 sgRNA 的经典方法。然而，IVT 具有几个明显的缺点。首先，通过 IVT 合成 sgRNA 非常耗费时间，并且很难对 sgRNA 的质量进行把控。此外，使用 IVT 合成的 sgRNA 有可能将 DNA 或其他污染物引入细胞。
化学合成的 sgRNA 与 IVT 合成的 sgRNA 相比具有许多优点。首先，因为前者是通过化学反应合成的，所以这些 sgRNA 所需的制备时间更短。同时，化学合成的 sgRNA 也比 IVT 合成的 sgRNA 纯度更高，这使得其编辑效率和结果的一致性更高。化学合成的 sgRNA 还可以在特定的核苷酸残基处进行化学修饰以抵抗核酸外切酶和免疫降解，进一步提高编辑效率。所有这些因素使得化学合成 sgRNA 成为 CRISPR 编辑的更可靠选择。
因为化学合成的 sgRNA 比 IVT 合成的 sgRNA 质量更高且可以调控，所以前者可以根据不同的 CRISPR 实验去优化至最佳条件。本文章将逐步讲解如何优化化学合成的 sgRNA。遵循这些步骤将确保您化学合成的 sgRNA 大幅优于 IVT 合成的 sgRNA，增加您对实验结果的信心。
说明
步骤1：优化 sgRNA 和 Cas9 的摩尔比
我们建议将 sgRNA 和 Cas9 预先复合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）来进行实验。使用 RNP 转染可以让您更好地控制 sgRNA 和 Cas9 的摩尔比，并保护 sgRNA 免于降解。确定特定细胞类型的最佳 RNP 的摩尔比非常重要，我们建议从 1:1 的摩尔浓度比（sgRNA: Cas9）开始测试。通过实验确定在您的细胞类型中产生最高编辑效率的 sgRNA: Cas9 摩尔比，并在以后的实验中保持这个比例。
步骤2：优化 RNP 浓度
一般来说，增加 RNP 的摩尔浓度会倾向于提高编辑效率。然而，随着 RNP 浓度继续增加，编辑效率将趋于平稳，并且可能具有潜在的细胞毒性。因此，通过进行剂量反应实验确定最佳 RNP 浓度非常重要。根据所使用的转染系统不同，最佳浓度可能会有所不同。我们建议在测试细胞系时 RNP 浓度范围保持在 0.5μM-1μM，而原代细胞的 RNP 浓度范围为 0.5μM-100μM（保持体积恒定）。
步骤3：对每个靶基因测试多个 sgRNA
一旦确定了您的 RNA 最佳摩尔比和浓度，就需要比较多个 sgRNA。因为并非所有 sgRNA 都有一样高的编辑效率，所以此步骤对于识别有效的 sgRNA 非常重要。同时，我们也建议同时测试具有化学修饰的 sgRNA 是否在您的细胞类型中产生更高的编辑效率。在原代细胞和干细胞中，经化学修饰的合成 sgRNA 通常有着更高的编辑效率。
小结
现在就想体验化学合成的 sgRNA？我们现已推出经过验证的 sgRNAs、化学修饰的合成 sgRNAs、满足临床试验需求的 GMP sgRNA 以及您的任意基因编辑实验所需的定制的高级 RNA。从今天起，让您的基因编辑实验更上一层楼！
北京赛百盛基因技术有限公司
全国统一热线：400 666 3029
化学合成的 sgRNA 与 IVT 合成的 sgRNA 相比具有许多优点。首先，因为前者是通过化学反应合成的，所以这些 sgRNA 所需的制备时间更短。同时，化学合成的 sgRNA 也比 IVT 合成的 sgRNA 纯度更高，这使得其编辑效率和结果的一致性更高。化学合成的 sgRNA 还可以在特定的核苷酸残基处进行化学修饰以抵抗核酸外切酶和免疫降解，进一步提高编辑效率。所有这些因素使得化学合成 sgRNA 成为 CRISPR 编辑的更可靠选择。
因为化学合成的 sgRNA 比 IVT 合成的 sgRNA 质量更高且可以调控，所以前者可以根据不同的 CRISPR 实验去优化至最佳条件。本文章将逐步讲解如何优化化学合成的 sgRNA。遵循这些步骤将确保您化学合成的 sgRNA 大幅优于 IVT 合成的 sgRNA，增加您对实验结果的信心。
说明
- 为了获得最佳结果，我们建议使用与 Cas9 核酸酶复合的化学修饰的 sgRNA 作为核糖核蛋白（RNP）。然而，您也可以使用其他 sgRNA/Cas9 形式进行实验，包括未修饰的 sgRNA，Cas9 mRNA 或 Cas9 表达细胞。
- 所有优化和比较实验应在相同的细胞系或培养物中进行，并包括所有相关的阳性和阴性对照。
- 在比较时，确保 IVT 合成的 sgRNA 和化学合成的 sgRNA 具有相同的序列。
- 在优化细胞系中的摩尔比和 RNP 浓度后，我们建议对每个靶基因测试多个 sgRNA，以确定哪些序列可以产生最高的编辑效率。
步骤1：优化 sgRNA 和 Cas9 的摩尔比
我们建议将 sgRNA 和 Cas9 预先复合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）来进行实验。使用 RNP 转染可以让您更好地控制 sgRNA 和 Cas9 的摩尔比，并保护 sgRNA 免于降解。确定特定细胞类型的最佳 RNP 的摩尔比非常重要，我们建议从 1:1 的摩尔浓度比（sgRNA: Cas9）开始测试。通过实验确定在您的细胞类型中产生最高编辑效率的 sgRNA: Cas9 摩尔比，并在以后的实验中保持这个比例。
步骤2：优化 RNP 浓度
一般来说，增加 RNP 的摩尔浓度会倾向于提高编辑效率。然而，随着 RNP 浓度继续增加，编辑效率将趋于平稳，并且可能具有潜在的细胞毒性。因此，通过进行剂量反应实验确定最佳 RNP 浓度非常重要。根据所使用的转染系统不同，最佳浓度可能会有所不同。我们建议在测试细胞系时 RNP 浓度范围保持在 0.5μM-1μM，而原代细胞的 RNP 浓度范围为 0.5μM-100μM（保持体积恒定）。
步骤3：对每个靶基因测试多个 sgRNA
一旦确定了您的 RNA 最佳摩尔比和浓度，就需要比较多个 sgRNA。因为并非所有 sgRNA 都有一样高的编辑效率，所以此步骤对于识别有效的 sgRNA 非常重要。同时，我们也建议同时测试具有化学修饰的 sgRNA 是否在您的细胞类型中产生更高的编辑效率。在原代细胞和干细胞中，经化学修饰的合成 sgRNA 通常有着更高的编辑效率。
小结
- 相对于 IVT 合成的 sgRNA，化学合成的 sgRNA 在质量和编辑效率方面表现更加优异。
- 建议将 CRISPR 组分作为核糖核蛋白（RNPs）引入细胞。
- 当切换到使用化学合成的 sgRNA 时，有必要针对您的细胞类型重新优化 CRISPR 组分的摩尔比和 RNP 浓度。
- 测试化学修饰是否能提升您的细胞类型的编辑效率。
- 优化完成后，建议对每个靶基因测试多个 sgRNA，以确定有效的 sgRNA。
现在就想体验化学合成的 sgRNA？我们现已推出经过验证的 sgRNAs、化学修饰的合成 sgRNAs、满足临床试验需求的 GMP sgRNA 以及您的任意基因编辑实验所需的定制的高级 RNA。从今天起，让您的基因编辑实验更上一层楼！
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