用从细胞中纯化的组分在体外重建细胞中的过程不仅仅是了解生命系统的有力方法，而且还会推动生物技术的革命性进展。例如，当今分子生物学中最重要的技术之一——聚合酶链式反应（PCR）——就是通过将细胞内的核酸扩增所需的成分进行重构，让研究人员能够在体外快速有效地扩增数千个碱基对的 DNA。这一无细胞体系具备了特异性强、灵敏度高、快速简便等特点，除了在核酸基础研究领域被应用，也被广泛使用在感染性疾病的检测、肿瘤的分型分期、遗传病的诊断等临床应用。

随着合成生物学技术的不断发展，科学家开始寻找合成和扩增更长的 DNA 片段的新方法。新兴技术已经可以合成达到整个细菌基因组大小的 DNA，从而构建出由合成基因组控制的人工细菌。然而全基因组和质粒的扩增仍然依赖于在活体宿主细胞中的繁殖，这既耗时又费力。在实验过程中，研究人员通常需要 1）制备感受态细胞、2）转化质粒进入细菌、3）筛选转化成功的细菌、4）扩增转化细菌、5）提取并纯化质粒等，这个过程往往需要数天的时间。因此，我们在想，是否存在一种方法能让我们在体外构建质粒扩增的过程，用创新的技术来简化这个过程呢？

基于这样的想法，一种革命性的、无细胞的大规模 DNA 组装和扩增技术诞生了！这一技术可以有效地取代传统的大肠杆菌克隆过程，成功在体外构建由生物分子组成的质粒扩增系统。这一扩增体系使用了从大肠杆菌中纯化的近 30 中酶，涵盖了起始（DnaA、IHF 等）、延伸（DnaB Helicase、DnaC Helicase loader、Gyrase、Pol III HE 等）、终止（RNase H、Pol I、Ligase 等）和分离（Topo IV、Topo III、RecQ 等）。



这个革命性的技术具有以下特征：1）易于操作：仅需一步等温反应，全流程无需细胞；2）灵敏度高：在 30°C 下 3 小时内产生高达 100 ng/µl 的超螺旋 DNA，即使起始只有单个 DNA 分子（对于 10 KB DNA）；3）保真度高：错误率仅为 10-8/bp，比传统 PCR 高近 10000 倍；4）范围广泛：适用于从 1 KB 到 1 MB 的不同大小的 DNA 片段；5）兼容性强：适用于任何序列，包括富含 GC 的序列。

为了配合这一技术，我们也同时开发了高性能的 DNA 组装试剂盒，最高可组装多达 50 个 DNA 片段，长度高达 200 KB。通过这两个技术，我们搭建了完整的 Cell-Free 克隆系统，可以进行无细胞体系的组装和扩增质粒，而无需对大肠杆菌转化和培养。该产品不仅可以大大简化实验流程，还可以扩大可操作的 DNA/ 质粒范围。



从今天起，摆脱掉大肠杆菌，来探索全新的无细胞体系质粒扩增黑科技吧！