锁核酸（LNA）是一种含有桥接双环糖基（bridged, bicyclic sugar moiety）的合成核酸类似物。在 2'-O-和 4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为 3'-内构象（3’-endo conformation，见图 2）。这种构象形成了 A 型 RNA 的特征结构。由于这种双环糖骨架的限制，LNA 只会形成A型双链体。此外，LNA 完全遵守 Watson-Crick 的碱基配对原则。因此 LNA：DNA 杂交双链体可以由序列互补的 DNA 和 LNA 自发形成，并且研究发现，LNA：DNA 杂交体与其对应的 DNA：DNA 相比，其退火温度会大幅度升高^[1]。由于 LNA 的合成与标准寡核苷酸合成相容，因此可以直接将单个或多个 LNA 核苷酸位点选择性地掺入 DNA 序列中。这些含有 LNA 的寡核苷酸与它们的互补的 DNA 序列退火后形成嵌合 LNA：DNA 杂交体。这些杂交体也均为 A 型构象，并且与相应的 DNA：DNA 双链相比，Tm值也会显著升高。粗略估算，每个掺入短 DNA 引物（<30 nt）的 LNA 核苷酸可使 Tm 值增加 3-8°C ^[2]。总而言之，LNA 的主要优点在于其可对所需寡核苷酸的 Tm 值进行微调，从而成为引物和探针设计时的选择。由于结合亲和力更强，所以可以合成更短的探针，同时其对目的 DNA 的结合特异性也更强。因此，推荐将LNA用于需要高特异性和/或可重复性的任何杂交检测，例如 PCR 引物、双标记探针、原位杂交探针和分子信标。此外，由于相同的原因，LNA 修饰的寡核苷酸也可以成为反义药物开发的一种有趣的候选物 ^[3]。 提高 qPCR 探针的热稳定性
LNA 优异的杂交特性使其可在 qPCR 探针的设计中被用来微调 Tm 值 ^[4]。这一特点显著拓宽了检测条件的范围，令 qPCR 实验更成功。当探针由LNA核苷酸组成时，能够改善其对靶序列杂交的亲和力和特异性。这反过来减少了虚假结合的背景荧光，并且有更好的信噪比。

多重 qPCR 系统
由于可以使用 LNA 调整 qPCR 探针的 Tm 值，因此可以获得具有不同 GC 含量的几个短序列的标准化 Tm 值。例如，富含AT的天然状态 DNA qPCR 探针通常需要超过 30 个碱基长（有时需要超过 40 个）以满足扩增子设计指南，但仍有可能表现不佳。使用 LNA qPCR 探针，通过选择性定位 LNA 核苷酸，有助于产生最佳的、具有高度特异性的短探针。较窄的Tm值范围对于微阵列和多重 PCR 应用特别有益，特别是当探针必须在相同条件下与许多不同靶标的同时结合时。

增强对单核苷酸的识别
掺入 LNA 核苷酸后，由于 LNA 在错配形成 Watson-Crick 碱基对时具有强烈倾向，因此 qPCR 探针通过单核苷酸多态性（SNP）区分等位基因的能力会大大增强^[5]。热变性研究表明，当 LNA 掺入在寡核苷酸的特定位置时，完美匹配和错配之间的Tm值存在显著差异（见图3）。因此，在 SNP 测定中，与天然状态 DNA 探针相比，LNA qPCR 探针杂交具有更强的不稳定性因此能够更好地区分出错配。 反义技术（Antisense Technology）
由于对互补核酸的结合亲和力增强，LNA 很有可能被用于反义技术，与此同时 LNA 的高核酸酶抗性是体内和体外应用的重要优势。大量研究证实了 LNA 作为反义试剂的优越性，常规技术即可用于转染 LNA 寡核苷酸。对于 knockdown microRNA 或其他小 RNA 等实验目的，可以通过设计 LNA 反义寡核苷酸以通过碱基配对与其靶序列杂交。另外，还可以通过引入硫代磷酸酯骨架以获得更强的核酸酶抗性。

参考文献
1. Vester, B.; Wengel, J. LNA (Locked Nucleic Acid): High-Affinity Targeting of Complementary RNA and DNA. Biochemistry 2004, 43 (42), 13233-13241.
2. Singh, S.; Nielsen, P.; Koshkin, A.; Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications 1998, No. 4, 455-456.
3. Veedu, R. N.; Wengel, J. Locked nucleic acids: promising nucleic acid analogs for therapeutic applications. Chemistry & biodiversity 2010, 7 (3), 536-42.
4. Letertre, C.; Perelle, S.; Dilasser, F.; Arar, K.; Fach, P. Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5’-nuclease PCR assays. Molecular and cellular probes 2003, 17 (6), 307-11.
5. Johnson, M. P.; Haupt, L. M.; Griffiths, L. R. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic acids research 2004, 32 (6), e55.

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